NERVE GROWTH FACTOR; IPERATTIVITÀ DETRUSORIALE; OSTRUZIONE CERVICO-URETRALE; MEDIATORI LIPIDICI
Livelli tissutali vescicali di Nerve Growth Factor (NGF) in pazienti con iperattività detrusoriale prima e dopo terapia e relazione con la produzione di mediatori di natura lipidica.
Università degli Studi di Perugia
Abstract
Studi sperimentali indicano che l'iperattività detrusoriale su base ostruttiva, neurogena e non neurogena, possa essere determinata da un'esaltazione del riflesso minzionale indotto dall'azione del Nerve Growth Factor (NGF) a livello delle fibre vescicali sensitive di tipo C. Tuttavia, altri meccanismi ben più complessi potrebbero essere implicati nella genesi e nel mantenimento dell'iperattività detrusoriale dopo ostruzione cervico-uretrale. I cannabinoidi endogeni (anandamide) ridurrebbero l'iperattività detrusoriale indotta dalla somministrazione topica di NGF mediante un'azione inibitoria a livello delle fibre C.
Gli isoprostani endovescicali, prodotti dello stress ossidativo, potrebbero avere un ruolo eccitatorio sullo sviluppo della disfunzione. In aggiunta la vescica umana produce prostaglandine (attraverso la via della ciclossigenasi) che sarebbero coinvolte nella genesi delle contrazioni vescicali involontarie. Tutti questi meccanismi devono essere investigati e confermati nell'uomo.
Il trattamento dell'iperattività detrusoriale può essere volto al blocco del braccio afferente del riflesso minzionale. I vanilloidi somministrati per via intravescicale inducono una desensibilizzazione delle fibre C agendo su recettori specifici e determinano un incremento della capacità vescicale e una riduzione dell'incontinenza da urgenza in pazienti con iperattività neurogena e non neurogena. L'applicazione intravescicale della Tossina botulinica A determina un blocco del braccio efferente del riflesso minzionale mediante inibizione del rilascio di acetilcolina a livello della giunzione neuromuscolare. Non è noto se la neurotossina abbia una qualche influenza nei meccanismi che regolano l'espressione dell'NGF. Nell'ambito delle terapie convenzionali dell'iperattività con ostruzione gli alfa-adrenergici rappresentano una valida scelta terapeutica specialmente nei pazienti anziani con ipertrofia prostatica benigna.
Gli obiettivi del presente studio sono: determinare le concentrazioni di NGF vescicale in controlli sani e in pazienti con iperattività detrusoriale neurogena e non neurogena e stabilire le relazioni esistenti tra NGF e mediatori lipidici endovescicali. Inoltre verrà valutata la risposta a differenti trattamenti (Resiniferatossina e Tossina botulinica A intravesicali, Tamsulosina per via orale) in termini non solo clinici e urodinamici, ma anche biochimici mediante indagine sulle eventuali modificazioni nel contenuto di NGF e mediatori lipidici endovescicali.
Il presente studio verrà condotto in due fasi: 1) messa a punto di tecniche di misurazione dell'NGF e dei mediatori lipidici su frammenti bioptici vescicali, apportando eventuali modificazioni alle pre-esistenti tecniche investigative (ELISA). Tale fase sarà condotta dall'Unità B, che successivamente eseguirà le determinazioni dei suddetti mediatori nei controlli sani e nei pazienti con vescica iperattiva; 2) selezione e inclusione dei pazienti nello studio; valutazioni cliniche, urodinamiche ed endoscopiche, somministrazione delle terapie e prelievi dei frammenti bioptici: tali compiti verranno eseguiti dall'Unità A. <<<
Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Massimo PORENA Università degli Studi di PERUGIA
Obiettivo del Programma di Ricerca
L'iperattività detrusoriale è una disfunzione vescicale, evidenziabile all'esame urodinamico, caratterizzata dalla presenza di contrazioni detrusoriali non inibite che insorgono durante la fase di riempimento del riflesso minzionale. Essa può essere causata da patologie neurogene o non neurogene e, in entrambi i casi, il meccanismo fisiopatologico è rappresentato da una concomitante condizione di ostruzione cervico-uretrale. Recenti evidenze sperimentali e cliniche suggeriscono che l'iperattività detrusoriale neurogena e non neurogena si accompagna a modificazioni fenotipiche delle fibre nervose afferenti sensitive (fibre C amieliniche), determinate dall'azione di un fattore neurotrofico endovescicale, denominato "Nerve Growth Factor" (NGF). Il contenuto di NGF aumenta nelle vesciche ipertrofiche di ratti con lesione del midollo spinale o sottoposti ad ostruzione cervico-uretrale mediante legatura parziale dell'uretra. L'NGF determina una "upregulation" di recettori localizzati a livello delle fibre C afferenti, le quali si trasformano in meccanocettori ed attivano il riflesso minzionale.
Nella fisiopatologia dell'iperattività detrusoriale un ruolo importante sembra essere svolto dallo "stress ossidativo". Gli Isoprostani, sostanze terminali prostaglandino-simili della perossidazione dell'acido arachidonico, sono il prodotto di un meccanismo "free radical -catalyzed", e sono gli unici markers specifici degli stress ossidativi; si ritiene che essi possano essere coinvolti nella genesi o nel mantenimento dell'iperattività detrusoriale. In aggiunta, la vescica umana è in grado di produrre prostaglandine attraverso la via della ciclossigenasi (COX), le quali risulterebbero essere coinvolte nei meccanismi che conducono alla comparsa delle contrazioni vescicali involontarie. Tuttavia, non è ancora chiaro se le prostaglandine e i trombossani contribuiscano alla patogenesi dell'iperattività detrusoriale. Degno di nota è il fatto che il fattore limitante la sintesi degli eicosanoidi è l'attivazione della fosfolipasi A2, che rilascia acido arachidonico, il substrato per le reazioni catalitiche delle ciclossigenasi.
Inoltre, è stato ipotizzato che alcuni cannabinoidi endogeni possano svolgere un'azione inibitoria diretta proprio a livello delle terminazioni sensitive C, determinando così un effetto opposto a quello dell'NGF sul riflesso minzionale. Tutte queste ipotesi devono essere oggetto di investigazione e di conferma nell'uomo.
Di recente sono state introdotte nuove strategie terapeutiche per l'iperattività detrusoriale, quali la somministrazione intravescicale di agenti vanilloidi, o l'infiltrazione intradetrusoriale di tossina botulinica A, o la somministrazione per via orale di bloccanti alfa-adrenergici, ma non vi sono ancora informazioni sull'azione che tali farmaci determinerebbero a livello della produzione tissutale vescicale di NGF.
Gli scopi del presente progetto sono: 1) determinazione della concentrazione tissutale vescicale di NGF in pazienti affetti da iperattività detrusoriale neurogena e non neurogena ed in controlli sani, e determinazione delle possibili interazioni tra contenuto di NGF e cannabinoidi (anandamide), ed isoprostani endovescicali; 2) determinazione, in un gruppo di pazienti selezionati, delle concentrazioni tissutali vescicali di NGF, anadamide ed isoprostani prima e dopo terapia farmacologica per l'iperattività detrusoriale (somministrazione intravescicale di vanilloidi, tossina botulinica A, e terapia orale con bloccanti alfa-adrenergici; 3) confronto tra risultati clinici ed urodinamici prima e dopo trattamento, con le concentrazioni endovescicali di NGF, anandamide ed isoprostani. <<<
Risultati parziali attesi
Analisi Statistica
In una prima fase potrà essere utilizzata un'analisi univariata a scopo esplorativo, seguita poi da un'analisi multivariata per mettere in evidenza i molteplici rapporti tra le variabili in studio.
Nella descrizione del disegno della presente ricerca sono importanti soprattutto le grandezze campionarie necessarie per ottenere la capacità statistica adatta agli scopi dello studio stesso.
Sulla base di un precedente studio (risultati preliminari non pubblicati) possiamo disporre dei seguenti dati in pazienti affetti da iperattività detrusoriale ed ostruzione cervico-uretrale neurogena:
NGF. Contenuto vescicale di NGF: 151.9 ± 64.6 (ng/ml)
CVI-t. Volume soglia delle contrazioni vescicale involontarie: 163.2 ± 61.4 (ml)
CVI-p. Pressione massima delle contrazioni vescicali involontarie: 55.1 ± 18.5 (cmH20)
CVC. Capacità vescicale cistomanometrica: 228.6 ± 75.6 (ml)
Ipotizzando che le variabili oggetto dello studio possano essere ricondotte con adeguate trasformazioni ad approssimare la distribuzione normale, possiamo calcolare la grandezza campionaria necessaria allo studio.
Nella tabella seguente sono riportate le grandezze campionarie per gruppo necessarie per ottenere una potenza del campione (1-b) di 0.80 assumendo a=0.05 per alcune variazioni percentuali (in aumento o in riduzione) delle variabili allo studio.
Variables-------Effect-size
-----------------10%----20%-----30%----40%
NGF-(ng/ml)------284----71------32-----18
CVI-t-(ml)-------223----56------25-----14
CVI-p-cmH2O)-----178----45----- 20-----11
CVC-(ml)---------173----43----- 20-----11
Poiché nel lavoro sopra citato abbiamo osservato variazioni percentuali delle variabili allo studio comprese tra il 35% e il 128%, pensiamo che un campione di 35 soggetti per gruppo offra una adeguata potenza statistica per verificare gli obiettivi primari (A), e i secondari (A e B).
Tali valutazioni statistiche si riferiscono solo alle misurazioni dell'NGF, dato che è possibile fare una stima della potenza- campione poichè abbiamo a disposizione risultati preliminari della precedente esperienza. Lo stesso non è applicabile alla stima della potenza- campione per lo studio dei mediatori lipidici endovescicali, in quanto non esistono dati adeguati in letteratura.Obiettivi primari
A) Valutazione dell'efficacia della terapia orale (agenti bloccanti alfa-adrenergici) ed intravescicale (vanilloidi, tossina botulinica A) per l'iperattività detrusoriale con ostruzione cervico-uretrale, in termini clinici, urodinamici e neurofisiologici.
Obiettivi secondari
A) determinazione delle possibili differenze nei risultati clinici ed urodinamici tra i diversi trattamenti
B) determinazione delle differenze negli scores sulla qualità di vita prima e dopo terapia.
Analisi Statistica
In una prima fase potrà essere utilizzata un'analisi univariata a scopo esplorativo, seguita poi da un'analisi multivariata per mettere in evidenza i molteplici rapporti tra le variabili in studio.
Nella descrizione del disegno della presente ricerca sono importanti soprattutto le grandezze campionarie necessarie per ottenere la capacità statistica adatta agli scopi dello studio stesso.
Sulla base di un precedente studio (risultati preliminari non pubblicati) possiamo disporre dei seguenti dati in pazienti affetti da iperattività detrusoriale ed ostruzione cervico-uretrale neurogena:
NGF. Contenuto vescicale di NGF: 151.9 ± 64.6 (ng/ml)
CVI-t. Volume soglia delle contrazioni vescicale involontarie: 163.2 ± 61.4 (ml)
CVI-p. Pressione massima delle contrazioni vescicali involontarie: 55.1 ± 18.5 (cmH20)
CVC. Capacità vescicale cistomanometrica: 228.6 ± 75.6 (ml)
Ipotizzando che le variabili oggetto dello studio possano essere ricondotte con adeguate trasformazioni ad approssimare la distribuzione normale, possiamo calcolare la grandezza campionaria necessaria allo studio.
Nella tabella seguente sono riportate le grandezze campionarie per gruppo necessarie per ottenere una potenza del campione (1-b) di 0.80 assumendo a=0.05 per alcune variazioni percentuali (in aumento o in riduzione) delle variabili allo studio.
Variables-------Effect-size
-----------------10%----20%-----30%----40%
NGF-(ng/ml)------284----71------32-----18
CVI-t-(ml)-------223----56------25-----14
CVI-p-cmH2O)-----178----45----- 20-----11
CVC-(ml)---------173----43----- 20-----11
Poiché nel lavoro sopra citato abbiamo osservato variazioni percentuali delle variabili allo studio comprese tra il 35% e il 128%, pensiamo che un campione di 35 soggetti per gruppo offra una adeguata potenza statistica per verificare gli obiettivi primari (A), e i secondari (A e B).
Tali valutazioni statistiche si riferiscono solo alle misurazioni dell'NGF, dato che è possibile fare una stima della potenza- campione poichè abbiamo a disposizione risultati preliminari della precedente esperienza. Lo stesso non è applicabile alla stima della potenza- campione per lo studio dei mediatori lipidici endovescicali, in quanto non esistono dati adeguati in letteratura. <<<
Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
L'iperattività detrusoriale è una disfunzione urodinamica caratterizzata dalla presenza di contrazioni detrusoriali non inibite, causa di incontinenza urinaria, evidenziabili durante la fase di riempimento del riflesso minzionale. Può essere dovuta a condizioni neurogene e non neurogene e, in entrambi i casi, il meccanismo fisiopatologico è la presenza di una concomitante ostruzione cervico-uretrale. 1
Lesioni del midollo spinale al di sopra del tratto lombosacrale determinano un'alterazione del controllo sovraspinale della minzione, e conducono ad una riorganizzazione dei meccanismi nervosi che regolano le funzioni della vescica e dell'uretra. 2 Il danno midollare inizialmente induce la comparsa di un'areflessia detrusoriale con conseguente ritenzione urinaria, ed in seguito, induce l'emergenza di una minzione automatica, mediata da meccanismi spinali riflessi. La vescica diventa "iperattiva" e si può avere un'alterazione della coordinazione vescico-sfinterica (dissinergia detrusore-sfintere), fattore quest'ultimo in grado di indurre un'ostruzione cervico-uretrale. 2 Tali disfunzioni del basso tratto urinario conducono a molteplici complicazioni, quali incontinenza urinaria, infezioni urinarie ricorrenti, reflusso vescico-ureterale con possibile deterioramento della funzionalità renale.
Studi sperimentali e clinici indicano che l'iperattività detrusoriale dopo lesione midollare o a seguito di ostruzione vescico-sfinterica non neurogena, è da ricondursi almeno in parte a modificazioni fenotipiche delle fibre nervose sensitive amieliniche C. 1,3 Molteplici sono i meccanismi coinvolti nella plasticità dei neuroni afferenti vescicali nelle varie situazioni patologiche. E' stato suggerito ad esempio, che dopo lesione midollare le interazioni tra organo bersaglio e le vie afferenti sensitive vescicali possano essere mediate dall'incremento di fattori neurotrofici prodotti dall'organo bersaglio e trasportati in via retrograda sino al corpo delle cellule neuronali di competenza. E' noto che fattori trofici quali il Nerve Growth Factor (NGF), incrementano nelle vesciche ipertrofiche di ratti con lesione del midollo spinale. 3 Gli stessi meccanismi si verificano negli animali da esperimento in assenza di patologia neurologica, ma sottoposti a legatura parziale dell'uretra. 4 In questo caso, l'ostruzione cervico-uretrale darebbe luogo ad ipertrofia delle fibre detrusoriali e ad esaltazione del riflesso minzionale, proprio grazie ad un incremento dei livelli endovescicali di NGF. E' stato inoltre osservato che l'ipertrofia dei neuroni afferenti ed efferenti diretti alla vescica ipertrofica di ratti ostruiti viene in parte antagonizzata da procedure di immunizzazione contro l'NGF. 4 In aggiunta, studi recenti rivelano che la somministrazione endovescicale, acuta o cronica, di NGF può sensibilizzare le vie nervose afferenti vescicali ed indurre iperattività detrusoriale. 5 Globalmente queste osservazioni suggeriscono che l'NGF può essere coinvolto nei fenomeni di neuroplasticità che sottendono l'emergenza dell'iperattività detrusoriale dopo lesione del midollo spinale o dopo ostruzione cervico-uretrale di altra natura.
Proprietà dell'NGF
E' stato osservato che l'NGF influenza la sopravvivenza, la grandezza e la funzione dei neuroni afferenti e di quelli adrenergici di derivazione dalla cresta neurale. Nell'animale da esperimento, a seguito di una condizione di ostruzione cervico-uretrale, vengono osservate delle modificazioni nei neuroni sensitivi ed adrenergici, con incremento della Sostanza P e del contenuto di catecolammine. 1, 4-5 L'incremento dei livelli tissutali di NGF potrebbe risultare da alterazioni metaboliche delle fibre muscolari in risposta all'aumento del lavoro necessario per espellere le urine e/o dalla forza meccanica associata alla distensione vescicale. Dopo l'instaurarsi di una condizione ostruttiva, si verifica una relazione temporale tra l'incremento di NGF vescicale e le modificazioni delle strutture nervose che afferiscono alla vescica. Questa risposta delle strutture nervose autonomiche alla crescita muscolare, in realtà rappresenta un fenomeno più generale. 4 Un'ipertrofia dei neuroni dei gangli delle radici dorsali e dei gangli efferenti è stata riscontrata anche a seguito dell'ostruzione intestinale e in corso di ipertensione arteriosa. 4 Analogamente, elevati livelli di NGF si osservano nelle pareti intestinali e nei vasi sanguigni di questi animali. 4 Pertanto, un fenomeno di neuroplasticità NGF -dipendente, a livello del sistema nervoso autonomo, può essere coinvolto in molteplici disordini associati con l'ipertrofia del tessuto muscolare liscio.
NGF e Farmacoterapia
Una condizione di deprivazione di NGF a livello dei neuroni sensitivi afferenti è stata osservata dopo somministrazione di agenti vanilloidi. 5 La somministrazione intravescicale di capsaicina o resiniferatossina, due componenti della famiglia dei vanilloidi, determina un aumento della capacità vescicale ed una riduzione dell' incontinenza urinaria da urgenza, sia nelle iperattività detrusoriali neurogene che nelle forme non neurogene. 5,6 Le sostanze vanilloidi sono degli agenti esogeni, capaci di legarsi al recettore vanilloide tipo 1 (VR1), un canale ionico presente nelle membrane delle fibre nervose C sensitive. Tale recettore, capace di giocare un ruolo di primo piano nella percezione del dolore e nel controllo del riflesso minzionale, può essere iperstimolato dall'NGF. Gli agenti vanilloidi possono contrastare tale iper-regolazione mediante riduzione dell'up-take di NGF a livello dei neuroni sensitivi. In assenza di NGF il metabolismo dei neuroni sensitivi risulta fortemente alterato, la sensibilità ai vanilloidi ridotta, l'espressione del VR1 diminuita ed anche il contenuto di alcune sostanze, quali la SP e il CGRP risulta fortemente ridotto. 5 In tal modo si avrebbe una riduzione dell'attività afferente del riflesso minzionale e pertanto, anche l'iperattività detrusoriale sarebbe fortemente diminuita. Nella pratica clinica, la capsaicina e la resiniferatossina sono state recentemente impiegate nella terapia intravescicale dell'iperattività neurogena e non neurogena. 7,8 Le osservazioni preliminari dimostrerebbero che la resiniferatossina induce una significativa riduzione della frequenza giornaliera degli episodi di incontinenza urinaria ed un miglioramento significativo di tutti i parametri urodinamici indicativi di iperattività detrusoriale.
Più recentemente, è stata introdotta un'ulteriore terapia intravescicale mediante infiltrazione di tossina botulinica-A, la neurotossina del Clostridium Botulinum, che si è dimostrata efficace nell'incremento della capacità vescicale e nella riduzione degli episodi di incontinenza urinaria in pazienti affetti da iperattività neurogena. 9,10 La tossina botulinica A blocca il rilascio di acetilcolina dalle terminazioni nervose colinergiche a livello della giunzione neuromuscolare, determinando una paralisi del muscolo detrusore e un blocco del braccio efferente del riflesso midollare. Non è noto quale sia il destino dell'NGF vescicale dopo infiltrazione intradetrusoriale di tossina botulinica A; si può ipotizzare anche un'azione della neurotossina a livello del braccio afferente del riflesso, mediante una riduzione del contenuto di NGF a livello delle fibre muscolari lisce.
Nella terapia convenzionale dell'ostruzione cervico-uretrale e dell'iperattività detrusoriale, i farmaci bloccanti alfa-adrenergici giocano un ruolo di primo piano, particolarmente nei pazienti di età avanzata o in quelli affetti da ipertrofia prostatica benigna. Tali farmaci inducono una remissione dell'ostruzione determinando un rilascio delle fibre muscolari del collo vescicale e della ghiandola prostatica, attraverso un'azione di blocco dei recettori alfa-adrergici. 11 Attualmente non è noto quale sia la risposta delle fibre muscolari lisce vescicale a tale terapia, in termini di modificazione del contenuto di NGF.
NGF e interazioni con altri agenti molecolari nella fisiopatologia e nel controllo dell'iperattività detrusoriale:
L'iperattività detrusoriale indotta mediante trattamento loco-regionale con NGF può essere prevenuta dall'azione di cannabinoidi endogeni, quali anandamide e palmitoylethanolamide (PEA). Studi sperimentali hanno mostrato che l'anandamide è in grado di ridurre l'iperattività detrusoriale indotta dalla somministrazione intravescicale di NGF, tramite un'azione sui recettori CB1 e CB2. 12 Inoltre, è stato osservato che l'anadamide riduce in maniera significativa l'espressione del gene Fos a livello spinale di L6, indotta dall'NGF endovescicale. Non è tuttavia noto quale sia il contenuto endovescicale di anandamide nella vescica iperattiva, nè quali siano possibili modificazioni nella sua concentrazione a seguito di terapie che riducano i livelli di NGF endovescicale.
L'ostruzione cervico-uretrale e l‘iperattività detrusoriale possono determinare uno stress ossidativo e la liberazione di radicali liberi a livello della parete vescicale. 13,14 Studi nell'animale da esperimento hanno evidenziato che la distensione della parete vescicale o la contrazione della stessa contro un collo vescicale chiuso inducono un'ischemia significativa della parete vescicale e che la riperfusione dopo la sovradistensione incrementa i prodotti della perossidazione lipidica e i markers dello stress ossidativo. E' noto che gli isoprostani, sostanze prostaglandino-simili della
perossidazione dell'acido arachidonico, sono prodotti da un meccanismo "free radical-catalyzed" e rappresentano gli unici markers degli stress ossidativi. Osservazioni recenti hanno evidenziato che lo stress ossidativo gioca un ruolo importante nello sviluppo delle disfunzioni vescicali. La produzione degli isoprostani nella parete vescicale, come fattori dello stress ossidativo, è stata delucidata solo in parte e, allo stato attuale, non se ne conoscono gli effetti sulla contrattilità detrusoriale e le possibili correlazioni con i livelli di NGF vescicale. In più, non si conoscono ancora le relazioni esistenti tra i livelli tissutali vescicali di NGF e la produzione di prostanoidi derivanti dalla via della ciclossigenasi, e quali ripercussioni abbiano tali interazioni sulla funzionalità vescicale.
A tutt'oggi molti aspetti della fisiopatologia dell'ostruzione cervico-uretrale rimangono non esplorati nell'uomo. Non è noto se il contenuto di NGF delle fibre muscolari lisce e dei neuroni afferenti sia incrementato dopo ostruzione dovuta a lesione midollare o ipertrofia prostatica benigna. Inoltre, non sappiamo se regioni vescicali differenti funzionalmente (corpo, base e collo) siano capaci di produrre diverse concentrazioni del fattore neurotrofico.
Non si hanno conoscenze riguardo le possibili interazioni tra NGF e sostanze endogene della parete vescicale, quali i cannabinoidi, nella regolazione della contrattilità detrusoriale in soggetti sani e in pazienti ostruiti e con iperattività detrusoriale.
Infine, ulteriore argomento di particolare interesse è la possibilità di verificare la risposta alla terapia dell' ostruzione cervico-uretrale e dell'iperattività detrusoriale in termini di riduzione del contenuto tissutale vescicale di NGF.
Livelli tissutali vescicali di Nerve Growth Factor (NGF) in pazienti con iperattività detrusoriale prima e dopo terapia e relazione con la produzione di mediatori di natura lipidica.
Università degli Studi di Perugia
Abstract
Studi sperimentali indicano che l'iperattività detrusoriale su base ostruttiva, neurogena e non neurogena, possa essere determinata da un'esaltazione del riflesso minzionale indotto dall'azione del Nerve Growth Factor (NGF) a livello delle fibre vescicali sensitive di tipo C. Tuttavia, altri meccanismi ben più complessi potrebbero essere implicati nella genesi e nel mantenimento dell'iperattività detrusoriale dopo ostruzione cervico-uretrale. I cannabinoidi endogeni (anandamide) ridurrebbero l'iperattività detrusoriale indotta dalla somministrazione topica di NGF mediante un'azione inibitoria a livello delle fibre C.
Gli isoprostani endovescicali, prodotti dello stress ossidativo, potrebbero avere un ruolo eccitatorio sullo sviluppo della disfunzione. In aggiunta la vescica umana produce prostaglandine (attraverso la via della ciclossigenasi) che sarebbero coinvolte nella genesi delle contrazioni vescicali involontarie. Tutti questi meccanismi devono essere investigati e confermati nell'uomo.
Il trattamento dell'iperattività detrusoriale può essere volto al blocco del braccio afferente del riflesso minzionale. I vanilloidi somministrati per via intravescicale inducono una desensibilizzazione delle fibre C agendo su recettori specifici e determinano un incremento della capacità vescicale e una riduzione dell'incontinenza da urgenza in pazienti con iperattività neurogena e non neurogena. L'applicazione intravescicale della Tossina botulinica A determina un blocco del braccio efferente del riflesso minzionale mediante inibizione del rilascio di acetilcolina a livello della giunzione neuromuscolare. Non è noto se la neurotossina abbia una qualche influenza nei meccanismi che regolano l'espressione dell'NGF. Nell'ambito delle terapie convenzionali dell'iperattività con ostruzione gli alfa-adrenergici rappresentano una valida scelta terapeutica specialmente nei pazienti anziani con ipertrofia prostatica benigna.
Gli obiettivi del presente studio sono: determinare le concentrazioni di NGF vescicale in controlli sani e in pazienti con iperattività detrusoriale neurogena e non neurogena e stabilire le relazioni esistenti tra NGF e mediatori lipidici endovescicali. Inoltre verrà valutata la risposta a differenti trattamenti (Resiniferatossina e Tossina botulinica A intravesicali, Tamsulosina per via orale) in termini non solo clinici e urodinamici, ma anche biochimici mediante indagine sulle eventuali modificazioni nel contenuto di NGF e mediatori lipidici endovescicali.
Il presente studio verrà condotto in due fasi: 1) messa a punto di tecniche di misurazione dell'NGF e dei mediatori lipidici su frammenti bioptici vescicali, apportando eventuali modificazioni alle pre-esistenti tecniche investigative (ELISA). Tale fase sarà condotta dall'Unità B, che successivamente eseguirà le determinazioni dei suddetti mediatori nei controlli sani e nei pazienti con vescica iperattiva; 2) selezione e inclusione dei pazienti nello studio; valutazioni cliniche, urodinamiche ed endoscopiche, somministrazione delle terapie e prelievi dei frammenti bioptici: tali compiti verranno eseguiti dall'Unità A. <<<
Coordinatore Scientifico del Programma di Ricerca
Massimo PORENA Università degli Studi di PERUGIA
Obiettivo del Programma di Ricerca
L'iperattività detrusoriale è una disfunzione vescicale, evidenziabile all'esame urodinamico, caratterizzata dalla presenza di contrazioni detrusoriali non inibite che insorgono durante la fase di riempimento del riflesso minzionale. Essa può essere causata da patologie neurogene o non neurogene e, in entrambi i casi, il meccanismo fisiopatologico è rappresentato da una concomitante condizione di ostruzione cervico-uretrale. Recenti evidenze sperimentali e cliniche suggeriscono che l'iperattività detrusoriale neurogena e non neurogena si accompagna a modificazioni fenotipiche delle fibre nervose afferenti sensitive (fibre C amieliniche), determinate dall'azione di un fattore neurotrofico endovescicale, denominato "Nerve Growth Factor" (NGF). Il contenuto di NGF aumenta nelle vesciche ipertrofiche di ratti con lesione del midollo spinale o sottoposti ad ostruzione cervico-uretrale mediante legatura parziale dell'uretra. L'NGF determina una "upregulation" di recettori localizzati a livello delle fibre C afferenti, le quali si trasformano in meccanocettori ed attivano il riflesso minzionale.
Nella fisiopatologia dell'iperattività detrusoriale un ruolo importante sembra essere svolto dallo "stress ossidativo". Gli Isoprostani, sostanze terminali prostaglandino-simili della perossidazione dell'acido arachidonico, sono il prodotto di un meccanismo "free radical -catalyzed", e sono gli unici markers specifici degli stress ossidativi; si ritiene che essi possano essere coinvolti nella genesi o nel mantenimento dell'iperattività detrusoriale. In aggiunta, la vescica umana è in grado di produrre prostaglandine attraverso la via della ciclossigenasi (COX), le quali risulterebbero essere coinvolte nei meccanismi che conducono alla comparsa delle contrazioni vescicali involontarie. Tuttavia, non è ancora chiaro se le prostaglandine e i trombossani contribuiscano alla patogenesi dell'iperattività detrusoriale. Degno di nota è il fatto che il fattore limitante la sintesi degli eicosanoidi è l'attivazione della fosfolipasi A2, che rilascia acido arachidonico, il substrato per le reazioni catalitiche delle ciclossigenasi.
Inoltre, è stato ipotizzato che alcuni cannabinoidi endogeni possano svolgere un'azione inibitoria diretta proprio a livello delle terminazioni sensitive C, determinando così un effetto opposto a quello dell'NGF sul riflesso minzionale. Tutte queste ipotesi devono essere oggetto di investigazione e di conferma nell'uomo.
Di recente sono state introdotte nuove strategie terapeutiche per l'iperattività detrusoriale, quali la somministrazione intravescicale di agenti vanilloidi, o l'infiltrazione intradetrusoriale di tossina botulinica A, o la somministrazione per via orale di bloccanti alfa-adrenergici, ma non vi sono ancora informazioni sull'azione che tali farmaci determinerebbero a livello della produzione tissutale vescicale di NGF.
Gli scopi del presente progetto sono: 1) determinazione della concentrazione tissutale vescicale di NGF in pazienti affetti da iperattività detrusoriale neurogena e non neurogena ed in controlli sani, e determinazione delle possibili interazioni tra contenuto di NGF e cannabinoidi (anandamide), ed isoprostani endovescicali; 2) determinazione, in un gruppo di pazienti selezionati, delle concentrazioni tissutali vescicali di NGF, anadamide ed isoprostani prima e dopo terapia farmacologica per l'iperattività detrusoriale (somministrazione intravescicale di vanilloidi, tossina botulinica A, e terapia orale con bloccanti alfa-adrenergici; 3) confronto tra risultati clinici ed urodinamici prima e dopo trattamento, con le concentrazioni endovescicali di NGF, anandamide ed isoprostani. <<<
Risultati parziali attesi
Analisi Statistica
In una prima fase potrà essere utilizzata un'analisi univariata a scopo esplorativo, seguita poi da un'analisi multivariata per mettere in evidenza i molteplici rapporti tra le variabili in studio.
Nella descrizione del disegno della presente ricerca sono importanti soprattutto le grandezze campionarie necessarie per ottenere la capacità statistica adatta agli scopi dello studio stesso.
Sulla base di un precedente studio (risultati preliminari non pubblicati) possiamo disporre dei seguenti dati in pazienti affetti da iperattività detrusoriale ed ostruzione cervico-uretrale neurogena:
NGF. Contenuto vescicale di NGF: 151.9 ± 64.6 (ng/ml)
CVI-t. Volume soglia delle contrazioni vescicale involontarie: 163.2 ± 61.4 (ml)
CVI-p. Pressione massima delle contrazioni vescicali involontarie: 55.1 ± 18.5 (cmH20)
CVC. Capacità vescicale cistomanometrica: 228.6 ± 75.6 (ml)
Ipotizzando che le variabili oggetto dello studio possano essere ricondotte con adeguate trasformazioni ad approssimare la distribuzione normale, possiamo calcolare la grandezza campionaria necessaria allo studio.
Nella tabella seguente sono riportate le grandezze campionarie per gruppo necessarie per ottenere una potenza del campione (1-b) di 0.80 assumendo a=0.05 per alcune variazioni percentuali (in aumento o in riduzione) delle variabili allo studio.
Variables-------Effect-size
-----------------10%----20%-----30%----40%
NGF-(ng/ml)------284----71------32-----18
CVI-t-(ml)-------223----56------25-----14
CVI-p-cmH2O)-----178----45----- 20-----11
CVC-(ml)---------173----43----- 20-----11
Poiché nel lavoro sopra citato abbiamo osservato variazioni percentuali delle variabili allo studio comprese tra il 35% e il 128%, pensiamo che un campione di 35 soggetti per gruppo offra una adeguata potenza statistica per verificare gli obiettivi primari (A), e i secondari (A e B).
Tali valutazioni statistiche si riferiscono solo alle misurazioni dell'NGF, dato che è possibile fare una stima della potenza- campione poichè abbiamo a disposizione risultati preliminari della precedente esperienza. Lo stesso non è applicabile alla stima della potenza- campione per lo studio dei mediatori lipidici endovescicali, in quanto non esistono dati adeguati in letteratura.Obiettivi primari
A) Valutazione dell'efficacia della terapia orale (agenti bloccanti alfa-adrenergici) ed intravescicale (vanilloidi, tossina botulinica A) per l'iperattività detrusoriale con ostruzione cervico-uretrale, in termini clinici, urodinamici e neurofisiologici.
Obiettivi secondari
A) determinazione delle possibili differenze nei risultati clinici ed urodinamici tra i diversi trattamenti
B) determinazione delle differenze negli scores sulla qualità di vita prima e dopo terapia.
Analisi Statistica
In una prima fase potrà essere utilizzata un'analisi univariata a scopo esplorativo, seguita poi da un'analisi multivariata per mettere in evidenza i molteplici rapporti tra le variabili in studio.
Nella descrizione del disegno della presente ricerca sono importanti soprattutto le grandezze campionarie necessarie per ottenere la capacità statistica adatta agli scopi dello studio stesso.
Sulla base di un precedente studio (risultati preliminari non pubblicati) possiamo disporre dei seguenti dati in pazienti affetti da iperattività detrusoriale ed ostruzione cervico-uretrale neurogena:
NGF. Contenuto vescicale di NGF: 151.9 ± 64.6 (ng/ml)
CVI-t. Volume soglia delle contrazioni vescicale involontarie: 163.2 ± 61.4 (ml)
CVI-p. Pressione massima delle contrazioni vescicali involontarie: 55.1 ± 18.5 (cmH20)
CVC. Capacità vescicale cistomanometrica: 228.6 ± 75.6 (ml)
Ipotizzando che le variabili oggetto dello studio possano essere ricondotte con adeguate trasformazioni ad approssimare la distribuzione normale, possiamo calcolare la grandezza campionaria necessaria allo studio.
Nella tabella seguente sono riportate le grandezze campionarie per gruppo necessarie per ottenere una potenza del campione (1-b) di 0.80 assumendo a=0.05 per alcune variazioni percentuali (in aumento o in riduzione) delle variabili allo studio.
Variables-------Effect-size
-----------------10%----20%-----30%----40%
NGF-(ng/ml)------284----71------32-----18
CVI-t-(ml)-------223----56------25-----14
CVI-p-cmH2O)-----178----45----- 20-----11
CVC-(ml)---------173----43----- 20-----11
Poiché nel lavoro sopra citato abbiamo osservato variazioni percentuali delle variabili allo studio comprese tra il 35% e il 128%, pensiamo che un campione di 35 soggetti per gruppo offra una adeguata potenza statistica per verificare gli obiettivi primari (A), e i secondari (A e B).
Tali valutazioni statistiche si riferiscono solo alle misurazioni dell'NGF, dato che è possibile fare una stima della potenza- campione poichè abbiamo a disposizione risultati preliminari della precedente esperienza. Lo stesso non è applicabile alla stima della potenza- campione per lo studio dei mediatori lipidici endovescicali, in quanto non esistono dati adeguati in letteratura. <<<
Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica nazionale o internazionale
L'iperattività detrusoriale è una disfunzione urodinamica caratterizzata dalla presenza di contrazioni detrusoriali non inibite, causa di incontinenza urinaria, evidenziabili durante la fase di riempimento del riflesso minzionale. Può essere dovuta a condizioni neurogene e non neurogene e, in entrambi i casi, il meccanismo fisiopatologico è la presenza di una concomitante ostruzione cervico-uretrale. 1
Lesioni del midollo spinale al di sopra del tratto lombosacrale determinano un'alterazione del controllo sovraspinale della minzione, e conducono ad una riorganizzazione dei meccanismi nervosi che regolano le funzioni della vescica e dell'uretra. 2 Il danno midollare inizialmente induce la comparsa di un'areflessia detrusoriale con conseguente ritenzione urinaria, ed in seguito, induce l'emergenza di una minzione automatica, mediata da meccanismi spinali riflessi. La vescica diventa "iperattiva" e si può avere un'alterazione della coordinazione vescico-sfinterica (dissinergia detrusore-sfintere), fattore quest'ultimo in grado di indurre un'ostruzione cervico-uretrale. 2 Tali disfunzioni del basso tratto urinario conducono a molteplici complicazioni, quali incontinenza urinaria, infezioni urinarie ricorrenti, reflusso vescico-ureterale con possibile deterioramento della funzionalità renale.
Studi sperimentali e clinici indicano che l'iperattività detrusoriale dopo lesione midollare o a seguito di ostruzione vescico-sfinterica non neurogena, è da ricondursi almeno in parte a modificazioni fenotipiche delle fibre nervose sensitive amieliniche C. 1,3 Molteplici sono i meccanismi coinvolti nella plasticità dei neuroni afferenti vescicali nelle varie situazioni patologiche. E' stato suggerito ad esempio, che dopo lesione midollare le interazioni tra organo bersaglio e le vie afferenti sensitive vescicali possano essere mediate dall'incremento di fattori neurotrofici prodotti dall'organo bersaglio e trasportati in via retrograda sino al corpo delle cellule neuronali di competenza. E' noto che fattori trofici quali il Nerve Growth Factor (NGF), incrementano nelle vesciche ipertrofiche di ratti con lesione del midollo spinale. 3 Gli stessi meccanismi si verificano negli animali da esperimento in assenza di patologia neurologica, ma sottoposti a legatura parziale dell'uretra. 4 In questo caso, l'ostruzione cervico-uretrale darebbe luogo ad ipertrofia delle fibre detrusoriali e ad esaltazione del riflesso minzionale, proprio grazie ad un incremento dei livelli endovescicali di NGF. E' stato inoltre osservato che l'ipertrofia dei neuroni afferenti ed efferenti diretti alla vescica ipertrofica di ratti ostruiti viene in parte antagonizzata da procedure di immunizzazione contro l'NGF. 4 In aggiunta, studi recenti rivelano che la somministrazione endovescicale, acuta o cronica, di NGF può sensibilizzare le vie nervose afferenti vescicali ed indurre iperattività detrusoriale. 5 Globalmente queste osservazioni suggeriscono che l'NGF può essere coinvolto nei fenomeni di neuroplasticità che sottendono l'emergenza dell'iperattività detrusoriale dopo lesione del midollo spinale o dopo ostruzione cervico-uretrale di altra natura.
Proprietà dell'NGF
E' stato osservato che l'NGF influenza la sopravvivenza, la grandezza e la funzione dei neuroni afferenti e di quelli adrenergici di derivazione dalla cresta neurale. Nell'animale da esperimento, a seguito di una condizione di ostruzione cervico-uretrale, vengono osservate delle modificazioni nei neuroni sensitivi ed adrenergici, con incremento della Sostanza P e del contenuto di catecolammine. 1, 4-5 L'incremento dei livelli tissutali di NGF potrebbe risultare da alterazioni metaboliche delle fibre muscolari in risposta all'aumento del lavoro necessario per espellere le urine e/o dalla forza meccanica associata alla distensione vescicale. Dopo l'instaurarsi di una condizione ostruttiva, si verifica una relazione temporale tra l'incremento di NGF vescicale e le modificazioni delle strutture nervose che afferiscono alla vescica. Questa risposta delle strutture nervose autonomiche alla crescita muscolare, in realtà rappresenta un fenomeno più generale. 4 Un'ipertrofia dei neuroni dei gangli delle radici dorsali e dei gangli efferenti è stata riscontrata anche a seguito dell'ostruzione intestinale e in corso di ipertensione arteriosa. 4 Analogamente, elevati livelli di NGF si osservano nelle pareti intestinali e nei vasi sanguigni di questi animali. 4 Pertanto, un fenomeno di neuroplasticità NGF -dipendente, a livello del sistema nervoso autonomo, può essere coinvolto in molteplici disordini associati con l'ipertrofia del tessuto muscolare liscio.
NGF e Farmacoterapia
Una condizione di deprivazione di NGF a livello dei neuroni sensitivi afferenti è stata osservata dopo somministrazione di agenti vanilloidi. 5 La somministrazione intravescicale di capsaicina o resiniferatossina, due componenti della famiglia dei vanilloidi, determina un aumento della capacità vescicale ed una riduzione dell' incontinenza urinaria da urgenza, sia nelle iperattività detrusoriali neurogene che nelle forme non neurogene. 5,6 Le sostanze vanilloidi sono degli agenti esogeni, capaci di legarsi al recettore vanilloide tipo 1 (VR1), un canale ionico presente nelle membrane delle fibre nervose C sensitive. Tale recettore, capace di giocare un ruolo di primo piano nella percezione del dolore e nel controllo del riflesso minzionale, può essere iperstimolato dall'NGF. Gli agenti vanilloidi possono contrastare tale iper-regolazione mediante riduzione dell'up-take di NGF a livello dei neuroni sensitivi. In assenza di NGF il metabolismo dei neuroni sensitivi risulta fortemente alterato, la sensibilità ai vanilloidi ridotta, l'espressione del VR1 diminuita ed anche il contenuto di alcune sostanze, quali la SP e il CGRP risulta fortemente ridotto. 5 In tal modo si avrebbe una riduzione dell'attività afferente del riflesso minzionale e pertanto, anche l'iperattività detrusoriale sarebbe fortemente diminuita. Nella pratica clinica, la capsaicina e la resiniferatossina sono state recentemente impiegate nella terapia intravescicale dell'iperattività neurogena e non neurogena. 7,8 Le osservazioni preliminari dimostrerebbero che la resiniferatossina induce una significativa riduzione della frequenza giornaliera degli episodi di incontinenza urinaria ed un miglioramento significativo di tutti i parametri urodinamici indicativi di iperattività detrusoriale.
Più recentemente, è stata introdotta un'ulteriore terapia intravescicale mediante infiltrazione di tossina botulinica-A, la neurotossina del Clostridium Botulinum, che si è dimostrata efficace nell'incremento della capacità vescicale e nella riduzione degli episodi di incontinenza urinaria in pazienti affetti da iperattività neurogena. 9,10 La tossina botulinica A blocca il rilascio di acetilcolina dalle terminazioni nervose colinergiche a livello della giunzione neuromuscolare, determinando una paralisi del muscolo detrusore e un blocco del braccio efferente del riflesso midollare. Non è noto quale sia il destino dell'NGF vescicale dopo infiltrazione intradetrusoriale di tossina botulinica A; si può ipotizzare anche un'azione della neurotossina a livello del braccio afferente del riflesso, mediante una riduzione del contenuto di NGF a livello delle fibre muscolari lisce.
Nella terapia convenzionale dell'ostruzione cervico-uretrale e dell'iperattività detrusoriale, i farmaci bloccanti alfa-adrenergici giocano un ruolo di primo piano, particolarmente nei pazienti di età avanzata o in quelli affetti da ipertrofia prostatica benigna. Tali farmaci inducono una remissione dell'ostruzione determinando un rilascio delle fibre muscolari del collo vescicale e della ghiandola prostatica, attraverso un'azione di blocco dei recettori alfa-adrergici. 11 Attualmente non è noto quale sia la risposta delle fibre muscolari lisce vescicale a tale terapia, in termini di modificazione del contenuto di NGF.
NGF e interazioni con altri agenti molecolari nella fisiopatologia e nel controllo dell'iperattività detrusoriale:
L'iperattività detrusoriale indotta mediante trattamento loco-regionale con NGF può essere prevenuta dall'azione di cannabinoidi endogeni, quali anandamide e palmitoylethanolamide (PEA). Studi sperimentali hanno mostrato che l'anandamide è in grado di ridurre l'iperattività detrusoriale indotta dalla somministrazione intravescicale di NGF, tramite un'azione sui recettori CB1 e CB2. 12 Inoltre, è stato osservato che l'anadamide riduce in maniera significativa l'espressione del gene Fos a livello spinale di L6, indotta dall'NGF endovescicale. Non è tuttavia noto quale sia il contenuto endovescicale di anandamide nella vescica iperattiva, nè quali siano possibili modificazioni nella sua concentrazione a seguito di terapie che riducano i livelli di NGF endovescicale.
L'ostruzione cervico-uretrale e l‘iperattività detrusoriale possono determinare uno stress ossidativo e la liberazione di radicali liberi a livello della parete vescicale. 13,14 Studi nell'animale da esperimento hanno evidenziato che la distensione della parete vescicale o la contrazione della stessa contro un collo vescicale chiuso inducono un'ischemia significativa della parete vescicale e che la riperfusione dopo la sovradistensione incrementa i prodotti della perossidazione lipidica e i markers dello stress ossidativo. E' noto che gli isoprostani, sostanze prostaglandino-simili della
perossidazione dell'acido arachidonico, sono prodotti da un meccanismo "free radical-catalyzed" e rappresentano gli unici markers degli stress ossidativi. Osservazioni recenti hanno evidenziato che lo stress ossidativo gioca un ruolo importante nello sviluppo delle disfunzioni vescicali. La produzione degli isoprostani nella parete vescicale, come fattori dello stress ossidativo, è stata delucidata solo in parte e, allo stato attuale, non se ne conoscono gli effetti sulla contrattilità detrusoriale e le possibili correlazioni con i livelli di NGF vescicale. In più, non si conoscono ancora le relazioni esistenti tra i livelli tissutali vescicali di NGF e la produzione di prostanoidi derivanti dalla via della ciclossigenasi, e quali ripercussioni abbiano tali interazioni sulla funzionalità vescicale.
A tutt'oggi molti aspetti della fisiopatologia dell'ostruzione cervico-uretrale rimangono non esplorati nell'uomo. Non è noto se il contenuto di NGF delle fibre muscolari lisce e dei neuroni afferenti sia incrementato dopo ostruzione dovuta a lesione midollare o ipertrofia prostatica benigna. Inoltre, non sappiamo se regioni vescicali differenti funzionalmente (corpo, base e collo) siano capaci di produrre diverse concentrazioni del fattore neurotrofico.
Non si hanno conoscenze riguardo le possibili interazioni tra NGF e sostanze endogene della parete vescicale, quali i cannabinoidi, nella regolazione della contrattilità detrusoriale in soggetti sani e in pazienti ostruiti e con iperattività detrusoriale.
Infine, ulteriore argomento di particolare interesse è la possibilità di verificare la risposta alla terapia dell' ostruzione cervico-uretrale e dell'iperattività detrusoriale in termini di riduzione del contenuto tissutale vescicale di NGF.
[http://www.ricercaitaliana.it/prin/dettaglio_completo_prin-2004064451.htm#base]
